三花接骨散

摘要:了解三花接骨散使血清內生長激素(GH)的濃度變化與其促進骨折愈合的機理。
方法:骨折后、7、14、28日斷頭取血,用鼠生長激素放免試劑測定血清中GH濃度。同時取垂體稱重量,石蠟包埋切片進行垂體GH免疫組化染色,測定GH細胞面積及GH細胞內激素含量。
結論:服三花接骨散14天的骨折組血清GH濃度和垂體 GH細胞內激素含量均增高。結論:服藥后血清GH增高可能是三花接骨散促進骨折愈合的原因之一。

   動物實驗及臨床實踐已證實中藥三花接骨散有促進骨折愈合的作用。影響骨折愈合的因素是多方面的,本實驗為探討該中藥促進骨折愈合作用機理。于1996年8月至1997年10月著重研究了骨折愈合早期階段,三花接骨散對大鼠生長激素分泌的影響。

材料及方法
1、實驗動物。Wistar成年大鼠(首都醫科大學實驗動物科學部提供) ,雄性共48只,體重220~260g。試驗中同組同籠(每籠6只)群養,飼養室溫度20~24°C,給予顆粒鼠飼料,試驗中自由食水及食物,不限量。
2、藥品。三花接骨散,由營口制藥總廠生產(批號: 951215)。樣品藥液制備:用5%阿拉伯膠液制成含2%三花接骨散的均勻混懸液。
3、骨折模型制作。大鼠以5%水合氯醛(0.15ml/100g)腹膜腔內注射,麻醉成功后,左后肢小腿剃毛常規碘酒酒精消毒,選左脛骨粗隆下外側縱切口,長約2.5cm,切開皮膚皮下,盡量勿傷皮下淺靜脈,切開脛骨肌,鈍分離至脛骨,沿脛骨骨膜繞周分離,內側分開趾側伸肌,注意勿傷隱動脈、脛前動脈和相應的神經,以小薄鋸橫斷脛骨,橫斷點在脛骨粗隆下約 1cm處,縫合骨膜前骨折復位縫合皮下與皮膚,以石膏(6層紗布做膝上2cm至足趾尖石膏筒固定,7天后拆除。
4、分組和喂藥。上述模型鼠隨機分為:A組服藥骨折組按樣品0.5ml/100g體重(劑量測算見藥理實驗方法學第二版中“人和動物間按體表面積折算等效劑量比值表”所規定的方法),用鼠灌胃器每日喂藥1次。B組單純骨折組(對照組) ,每日用鼠灌胃器喂相應量的5%阿拉伯膠液1次。
5、取血測血清 GH濃度 上述兩組試驗大鼠,分別于骨折后3、7、14、28天清醒下斷頭取血,每只取血10ml,自然凝固,室溫下低速離心(2000轉/分)15分鐘,取血清約2ml,貯存于-20°C備用。采用鼠GH放射免疫分析法(RIA)(試劑盒由美國 N HPP提供)測定血清GH(測試由北方生物技術研究所完成)。
6、垂體生長激素細胞免疫組化染色和測定大鼠斷頭后立即取出垂體,用Bouin固定液固定24h,取出用濾紙吸干固定液,用1/100000電子天平,稱垂體重量。垂體常規脫水,石蠟包埋。連續切片,厚度5μm,每例取其中部最大橫斷面,進行生長激素細胞免疫組織化學染色,試劑由美國NHPP提供的猴抗大鼠GH抗體為Ⅰ抗,以酶標金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)代替Ⅱ抗的間接法進行染色。Ⅰ抗最佳稀釋度為1∶200,金葡球蛋白A最佳稀釋度為1∶40,DAB顯色。設陰性對照。染色結果,用計算機灰度測試軟件(灰度分32級)進行垂體前葉生長激素細胞內GH含量相對含量。同時測定生長激素細胞面積大小。每例測20個生長激素細胞,求出均數,兩組間用t檢驗進行統計學處理。

結果
1、大鼠骨折后3天組間血清GH濃度比較,見表1。

   由表1知, A組和B組大鼠血清GH濃度B組比較A組數值高,但兩組間血清GH值經統計學(t檢驗)統計,P>0.05,均無明顯差異

 

2、大鼠骨折7天組間血清GH濃度比較,見表2。

   由表2知, A組和B組大鼠血清GH濃度A組較B組均數值有較明顯升高,但經統計學(t檢驗)處理,P>0.05,兩組間無明顯差異

 

3、大鼠骨折14天組間血清GH濃度比較,見表3。

   由表3知A組和B組大鼠血清GH濃度A組較 B組有明顯升高,經統計學(t檢驗)處理,t=2.45, P<0.05,兩組間有明顯差異。

 

4、大鼠骨折28天組間血 GH濃度比較,見表4。

由表4知, A組和B組大鼠血清GH濃度值經統計學(t檢驗)處理,兩組間無明顯差異。

 

5、垂體生長激素細胞免疫組化染色測定結果,見表5。

A組為服藥組。B組為服阿拉伯膠組。
*表示與實驗組比較P<0.001細胞內GH含量越高灰度值越低。
   由表5知,3天服藥組較對照組垂體生長激素細胞GH含量低,但7、14、28天組垂體細胞GH含量均高于對照組(灰度值低)經統計學(t檢驗)處理,兩組間均有顯著差異。

討論
1、生長激素在骨生長和骨折愈合中的作用生長激素(GH)由垂體前葉嗜酸細胞產生,以脈沖式的方式分泌,有明顯的種屬特異性。它是膠原生長的一種主要調節劑,在骨生長和骨折愈合中起著重要的作用。( 1)正常情況下,在肝內GH可刺激胰島素樣生長因子(IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ)生成, IGF-Ⅰ和IGFⅡ作為媒介物對成骨細胞都有很強的刺激作用。成骨細胞膜上有親和力的Ⅰ型和Ⅱ型IGF受體, IGF-Ⅰ和 IGF-Ⅱ可以明顯促進骨細胞的有絲分裂,影響成骨細胞的分化,興奮堿性磷酸酶活性,促進骨鈣素合成并增強骨連接素的基因表達。骨折后血清GH濃度增高,同時垂體生長激素細胞(即嗜酸細胞)也處于高機能狀態,上述的反應加強,促進骨折愈合。(2)GH對軟骨有直接作用,可促進生長板細胞分化和生長,而骨的生長取決于生長板軟骨內骨化,同時已證實GH能引起新骨生長。(3)GH可以改善腸鈣吸收,興奮腎臟1-羥化酶活性,使25(OH)D3轉換為1.25(OH)2D3濃度增高,后者活性強,形成骨鹽作用高于前者100倍。人類從成熟期開始,血清GH濃度開始下降,至65歲以后則大部分或全部消失,老年人GH水平的下降可以視為GHD(即GH缺乏)的一種形式,突出表現是骨密度下降。同時臨床工作中也發現中老年人骨折后愈合慢、愈合晚,而血清GH濃度較高的兒童階段,骨折后愈合快、愈合早。總之,GH對骨生長和骨折愈合有重要的影響,盡管骨折愈合的機理很復雜,有些問題尚未完全清楚,同時也絕非是GH單獨起作用,但GH的作用是不容置疑的。血清GH濃度降低將不利于骨折愈合,升高將有利于或促進骨折愈合。
2、試驗結果分析.由于血清GH分泌有脈沖式特點,所以檢測值波動較大,同時測定每批血清樣品時,標定曲線也不相同,因此分析每批血清GH濃度檢測值時,本試驗不做每批間橫向比較,只做組內分析比較。為使每批測定值準確,我們已盡量排除了干擾因素,在取血時間、取血環境、取血方法上做到組內條件一致。從結果知,骨折后服藥組與對照組血清GH濃度有一定的差異,骨折后 3天,兩組無明顯差異,骨折7天服藥組血清 GH濃度升高但經統計學處理,二者無明顯差異。至骨折14天時,服藥組和對照組比較,兩者有明顯的差異。而在骨折后28天時,兩組血清GH濃度水平又回到大體相等水平。說明三花接骨散在骨折后一定時間內有促進血清GH濃度升高的作用。另外,為了更準確地反映GH的分泌狀況,本試驗還對垂體生長激素細胞的體積和GH含量(用灰度值表示)進行了測定,其灰度值結果與血清GH濃度變化結果趨向是一致的。
   無論是血清GH濃度,還是垂體免疫組織化學測定結果,均表明在骨折后一定時間內,服藥組遠比自然骨折的變化要明顯。
   三花接骨散藥效學試驗和臨床觀察結果都表明,服用三花接骨散骨折后14天時,機體在新鮮骨折的部位有骨痂生長,與對照組比較有顯著差異,顯示了該藥促進骨折愈合的作用。與本試驗結果比較,兩者在時間上和結果上是一致的。所以作者認為:服用三花接骨散治療骨折后機體內血清GH濃度的特有表現可能是該藥促進骨折愈合的機理之一。

小結
   使用Wistar大鼠制作左脛骨骨折模型,分為服藥組和對照組,結果表明骨折后 14天服藥組與對照組GH濃度比較,有顯著性差異,垂體生長激素細胞 GH含量亦有相同趨向的改變,提示三花接骨散在骨折后一定時間內有增高血清GH濃度的作用,可能是三花接骨散促進骨折愈合機理之一,試驗尚需進一步加以證實,并經臨床觀察與總結。