三花接骨散

摘要:研究三花接骨散對垂體促進鼠骨折愈合的機制。方法是將Wistar鼠分成不同的組,于手術脛骨骨折后,每日喂服2%三花接骨散懸液(0.5ml/100g體重),對照組服5%阿拉伯膠。分別于服藥3、7、14及28天取出垂體觀察其重量 ,用圖象分析儀觀察經免疫組化染色的垂體生長激素細胞面積和灰度。結果表明鼠體重及垂體重量實驗組與對照組無明顯差異。但生長激素細胞的面積和灰度與對照組有明顯差異。除了三大組外,服三花接骨散的各實驗組生長激素細胞的面積和生長激素的含量均增高。但此變化在骨折愈合后或停藥后可以恢復到正常水平。由上述結果提示三花接骨散增加垂體生長激素細胞合成生長激素是其促進骨折愈合的機制之一。

   中藥三花接骨散有促進骨折愈合作用,已為動物實驗及臨床實踐所證實。本實驗用現代醫學研究手段來探索三花接骨散促進骨折愈合作用的機理。既往文獻報道,骨折后垂體生長激素細胞機能有所改變,故本文著重研究大鼠骨折后,服用三花接骨散對垂體生長激素細胞的影響。

材料和方法
1、實驗動物。Wistar雄性成年大鼠(首都醫科大學動物科學部提供) 54只,體重220g~260g。每批12只,每6只一組,同組同籠飼養。室溫18~24°C,顆粒鼠飼料,進食飲水不限。
2、實驗分組。本實驗分3天、7天、14天、28天四批進行,前三批共分兩組, A組(實驗組)為骨折后服三花接骨散組。B組(對照組)為骨折后服溶媒阿拉伯膠組。第四批28天則分為三組,除 A、B組外,C組為骨折后服藥14天停藥14天組,每組均為6只。
3、骨折模型制作。在5%水合氯醛(0.15ml /100g體重)腹腔麻醉下,備皮后經左脛前外側做縱行切口,逐層切開分離暴露脛骨,在脛骨結節下1cm處,用薄鋸橫斷,逐層縫合后,以石膏固定,7日后拆石膏。
4、喂藥方法。三花接骨散溶于5%阿拉伯膠呈2%的均勻混懸液,按0.5m1/100g體重(藥理實驗學方法第二版“人與動物間按體表面積折算等效劑量比值表”計算)鼠灌胃器,每日灌喂一次。對照組按體重相應數量灌喂阿拉伯膠溶液。于骨折當日麻醉清醒后即行第一次喂藥,連續至所定日期。
5、取材。按期測體重后斷頭處死大鼠,取血10m1,離心分離取血清做血清生長激素(GH)放免測定,試劑盒由美國NHPP提供。同時立即取垂體,用Bouin液固定,24小時后取出,用濾紙吸干,經1/100,000電子天秤稱重。
6、垂體。GH細胞免疫組織化學染色方法Bouin固定之垂體,常規脫水,石蠟包埋,連續切片,厚度為5μm,每例取中部最大橫切面進行GH細胞免疫組織化學染色。本實驗用酶標金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)代替二抗進行間接法染色,具體步驟如下:
(1)烤片、60° C、2hr
(2)常規二甲苯脫蠟、20min×2
(3)梯度酒精水化
(4)3%過氧化氫-甲醇、20min除去內源性過氧化物酶活性
(5)DW清洗×2
(6)0. 01M、PBS液(PH7.4)、5min×1
(7)正常羊血清( 1∶10)37° C、30min封閉除、去外源性過氧化物酶
(8)滴加Ⅰ抗, 37℃濕盒內孵育1小時后4℃過夜。Ⅰ抗為猴抗鼠GH抗體(美國NHPP提供)最佳稀釋度1∶200
(9)0. 01M、PBS液( PH7. 4) 5min×3
(10)滴加酶標金黃色葡萄球菌蛋白以(SPA)(上海科技生物所)代替Ⅱ抗,最佳釋度為1:40、37°C小時
(11)0. 01M、PBS液( PH7. 4)5min×3
(12)0. 05M、Tris- Hc1緩沖液、(PH7.65min×1
(13)DAB顯色
(14)中止反應,水洗,脫水,樹膠封片、每例設陰性對照
7、垂體。GH細胞面積及細胞內GH含量灰度測定:每例在顯微鏡高倍鏡(400×)下,隨機取 20個細胞,用計算機圖像分析,面積及灰度測試軟件進行測試。以像素值計算細胞面積,以灰度級(32級)表明細胞內GH含量,灰度級值越低代表含量越高。
8、統計分析。所得各數據用PRIMER軟件進行t檢驗、方差分析及Newman-Keuls(q檢驗)。

 


   由表1 t檢驗結果表明3天、7天、14天、28天各批實驗中,體重、垂體重量各實驗組(A)與對照組(B)比,均無顯著性差異(P>0.05),垂體GH細胞面積,3天A組均數小于B組(P<0.05)有顯著性差異。7天A組均數大于B組(P<0.05)有顯著差異, 14天、28天, A、B兩組均數相近,無顯著性差(P>0.05)。

 

   血清GH含量3天、7天、28天A組與B組均數均無顯著性差異,但3天A組還低于B組,而7天時A組已略高于B組,14天A組均數高于 B組有顯著性差異(P<0.05)。
   垂體GH細胞GH含量灰度級比較,3天A組灰度高于B組均數有顯著差異(P<0.05),7天、14天、28天A組灰度級均數低于B組,各組均數比較P<0.05,均有顯著差異(灰度級越低表示細胞內GH含量越高)。


 

 

服藥組與對照組相比細胞大小無明顯差異 ,但 GH染色濃度明顯深于對照組。

   為了檢驗服三花接骨散停藥后,垂體GH細胞變化是否可復原,故骨折 28天實驗組內另設骨折后服藥 14天再停藥 14天組(C),垂體GH細胞面積及灰度A、B、C三組進行方差分析及q檢驗。

結果
   各組大鼠外觀無異常改變,垂體肉眼結構亦未見明顯變化。A、B、C三組進行了兩兩比較,結果表明灰度級,B、C組與A組比較,分別均高于A組P<0.05有顯著性差異,但 B、C兩組比較無顯著性差異。GH細胞面積比較,各組兩兩均無顯著性差異。

討論
   三花接骨散能加速骨折愈合己有定論。該藥是中藥復方制劑,因此促進骨折愈合的機理肯定是多因素的,本研究組在進行三花接骨散藥效學實驗過程中,發現它有增強生長激素作用的跡象,故本實驗著重研究骨折后服用三花接骨散對垂體生長激素細胞的影響,以探索該藥作用機理。
   眾所周知,骨折發生后通過早期炎癥反應、巨噬細胞清掃、即進入骨折愈合的重要階段纖維性骨痂、原始性骨痂及繼發性骨痂形成,最后完成骨折愈合。這個復雜的過程是受著多種因素調控。人體生長激素對骨生長及骨折愈合有以下作用:生長激素在肝內可刺激胰島素樣生長因子(IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ)形成,該因子可刺激間葉細胞增殖,形成成纖維細胞及肌纖維母細胞。同時GH是骨基質膠原形成的一種主要調節劑。肌纖維母細胞、成纖維細胞與各型膠原在骨折局部形成纖維性骨痂。此后在原發及繼發性骨痂形成階段中,起最關鍵作用的兩種細胞-成骨及破骨細胞與GH亦有密切關系。
   成骨細胞能使骨折部位有足夠的骨痂形成,以恢復骨的連續性和堅強度。成骨細胞膜上有高親和力的Ⅰ型、Ⅱ型IGF受體, IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ可明顯促進骨細胞的有絲分裂。影響骨細胞的分化,而在GH影響下肝內和骨內形成IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ。Kassem等通過組織培養結果提出GH對人體成骨細胞直接發揮合成代謝作用。同時GH通過改善腸鈣吸收,并且能夠興奮腎臟1α-羥化酶活性,使25(OH)D3轉換為1,25(OH)2D3,從而使1,25(OH)2D3濃度增高。而成骨細胞上有1,25(OH)2D3受體,它可影響成骨細胞的形態,增加成骨細胞的數目及刺激成骨細胞合成骨鈣素的能力,增加骨量加速骨折愈合及加強骨的抗折強度。同時,1,25(OH)2D3在繼發骨痂形成階段,能刺激破骨細胞的前身單核巨噬細胞的分化及融合,影響破骨細胞的數目及活性。刺激骨吸收以恢復骨原來的形態.Bak-B等曾報導,動物實驗己證實骨折后應用生長激素治療,可增加骨折愈合負載。由此可見生長激素在促進骨折愈合過程中有極其重要的作用。
   早在60年代,陳奕權用垂體特殊染色觀察兔骨折后垂體前葉組織學變化,提出家兔骨折后 3天垂體 GH細胞略有減少,隨后逐漸增加,至14天達到最高峰,表現為細胞體積增大,分泌顆粒粗且多。第 17天后逐漸恢復正常。說明在骨折創傷修復一定期間內生長激素分泌細胞處于高機能狀態。

   上述過程與本實驗結果趨向是一致的。本實驗用美國NHPP提供的鼠GH生長激素免疫試劑,特異性顯示鼠垂體GH細胞。結果表明骨折后服用三花接骨散3天垂體細胞面積、灰度及血清GH均較對照組降低的更明顯。但以后7天、14天、28天則回升均較對照組明顯。血清GH值在 14天達最高峰與對照組比 P<0,05有高度顯著性差異。細胞面積14天、28天開始回落與對照組相近,而表明細胞內GH含量的灰度級實驗組一直高于對照組, P值均小于0.05。由此說明除骨折損傷及早期(3天)外,在開始修復期7天)以后,三花接骨散均有增加垂體GH分泌的作用,細胞形態學的變化(體積變大)維持的時間短于其機能變化( G H含量)的時間。但于骨折愈合第7至14日,GH的分泌是處于高峰階段,此變化與既往病理組織學變化的結果是一致的,支持了三花接骨散可能通過增加GH促進骨折愈合,是其作用機理之一的論斷。
   三花接骨散促進GH分泌的量是有限的,由本實驗各批動物體重及垂體重,實驗組與對照組均無明顯差異可證實它不足以引起機體的異常增長。特別通過28天三組方差及q檢驗結果,亦說明當骨折后服藥14天再停藥14天后,垂體的變化水平基本恢復到對照組水平。由此可見三花接骨散是既有促進GH分泌增加,加速骨折愈合的作用。又不會導致垂體內分泌紊亂的一種比較安全的藥物。